然而足利义辉拒绝了上泉秀纲、疋田景兼、丸目长惠等人的建议，仍然决定在二条御所内坚守。在双方激战多时后，足利义辉力斩百人，折损刀剑数柄，也已渐渐力怯，见三好军仍然如潮水一般涌来，层层密密，杀不尽，斩不绝，在见到二条御所已经被叛军完全包围地如同大海中的一叶孤舟，沉默的足利义辉已经对命运有所觉悟了，心知自己的大限已至，遂率众且战且退避入内室。
足利义辉知道上泉秀纲、疋田景兼、丸目长惠等人大都来自关东，并不希望他们在这里死于乱军之中，令他们护送自己的御台所（征夷大将军的正室）近卫氏（近卫植家之女）和两名嫡女离开二条御所，还令侧近细川辉经立即前去与三好家诸将交涉。
上泉秀纲、疋田景兼、丸目长惠等人也不再坚持，随即进入大广间内带着惊慌失措的近卫氏和足利义辉的两个女儿缓缓离开了。而三好三人众、松永久通等人也不愿意得罪公卿名门近卫家和时任关白近卫前久，故而只同意御台所近卫氏和足利义辉的两个女儿安然离开二条御所，而足利义辉最宠爱的侧室进士小侍从（进士晴舍之女）却没有那么好的运气了，三好三人众与松永久通等人直接拒绝了已经怀孕的进士小侍从离开二条御所。不过，足利义辉的另一位侧室则是在三好军还未完全将二条御所包围的时候悄悄的离开了。
足利义辉为了不让足利将军家（堀越公方系）就此断绝血脉，立即令近臣小早川外记、吉川斋宫等人护卫已经怀胎八月的侧室乌丸氏（出自藤原北家日野流）暂时前去与将军家暗中经常联系的讃岐国横井城城主尾池光永处藏匿。
“源氏千载梦幻碎，净火焚尽世间恶。五月细雨露如泪，愿寄我名登云霄。”足利义辉在仅剩的二十余名奉公众武士们的掩护下于大广间内写下了辞世诗（又称辞世句）。从镰仓时代开始，一直到明治维新过后，身为征夷大将军而亲自上阵挥剑杀敌的，恐怕就只有足利义辉一人了。
不久，二条御所的本丸各地都燃起了大火，火势渐渐逼近了大广间，足利义辉在大广间内继续奋战着。这时，足利义辉被三好军用长枪绊倒在地，随后蜂拥而来的三好军便将大广间的多扇纸门拆下并且压在了足利义辉的身上，使他动弹不得。之后，无数杆长枪刺入了足利义辉的身躯，不久后强情公方足利义辉咽了气。
足利义辉的生母庆寿院（近卫尚通之女、第十二代室町幕府将军足利义晴的正室）也在熊熊大火之中结束了自己的生命。而足利义辉最宠爱的侧室进士小侍从则在本丸庭院里的假山后被三好军找到并且杀害了。
就在足利义辉、庆寿院、进士小侍从等人死后，三好三人众与松永久通等人还是觉得不放心，认为足利义辉还有两位亲兄弟尚在人世，不可不剪除。这两人按照幕府将军家的惯例，都出家为僧了，一名法号为周暠，在京都鹿苑寺出家，一位法号为觉庆，在奈良兴福寺一乘院为僧。
永禄三年，七月五日。就当太阳下山之后，三好军迅速在京都各个关卡要道上做好了部署。总大将三好义继在其一门重臣三好政保的协助下率四千余军势于鸭川沿岸的三本木布下了本阵；松永久通率军一千余在乌丸一带待命；岩成友通率军一千余在室町一带待命；三好长逸率军两千余在西大路一带待命；三好政康率军两千余在勘解由小路一带待命。一万余三好军将二条御所包围的严严实实，甚至连一只鸟都快飞不进去了。
而京都东南方的鸟羽伏见两地则是由三好长直（摄津三好、尼崎豪族）和今村庆满（原细川氏纲家臣、出仕三好家后任山城国代官和小泉城城主）二人各率五百余军势驻守，鸟羽和伏见两地恰好扼守住出仕将军家的近江甲贺郡豪族通往京都的道路。在将三好长直和今村庆满布置在鸟羽和伏见两地后，三好三人众与松永久通等人还是觉得不放心，随后又派遣三好长胜（三好长逸一门众）、三好房一（三好康长家臣）、横田宗昭（三好家一门众）等人分别率军五百余驻守在鸟羽和伏见两地东北方地势较高的龙云寺、桃山、御香宫三地。
三好家诸将在各地全部布置妥当之后，夜里开始下起了雨。
明智光秀虽然身在坂本，但是对局势还是略知一二的。他很清楚眼下三好家派出一万三千余大军上洛肯定是来者不善善者不来，随即让先前来到京都修行的上泉秀纲、疋田景兼、丸目长惠（上泉秀纲弟子）等兵法家迅速进入二条御所护卫足利义辉，自己则是迅速在领内征召军势，以备不时之需。
上泉秀纲、疋田景兼、丸目长惠等人才小心翼翼的进入二条御所并且见到了足利义辉本人之后，所有人都没有想到，在今天夜里会发生一场震惊五畿七道六十余州的大变。
二条御所的大手门正对着室町大街，御所栋门的改修也已经完工，御所内的两座箭橹也修建完成了。
戊时过后，雨势稍微减弱了，到了亥时，部署在乌丸、室町、西大路、勘解由小路等地的三好军各部同时手持松明火把，从各自的所在地向着二条御所包抄而来。三好军一万余大军势向二条御所发起总攻击，为了获得绝对的优势，这支三好军一共装备了一千五百挺铁炮，非常大胆的从四个方向同时发动攻击。
与此同时，足利义辉正坐在静室里盯着上百柄太刀发呆，伸手取来那柄天下的著名太刀童子切安纲，缓缓抽出露出雪亮的刀刃，光滑如镜的刀背上映照出那张瘦削清癯的面容。
“是什么声音？！”正在擦刀的足利义辉瞬间起身拉开纸门走到走廊上，他随即想到了占据着京畿大部分的三好家和近江的六角家，难道是他们起兵反叛了？